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                上海PT白狮生物》科技有限公司(Shanghai Gemple Biotech Co.Ltd)於2010年3月,由國內外知名學府的多名生命科學和臨床醫學從業者始立。公司落戶在張江高科生物□醫藥核心園區,專註於新一代技術在遺傳病的臨床檢測以及科研轉化兩大領域的產業化應用。PT白狮長期致力↙於遺傳病從分子診斷到疾病建模—遺傳疾↙病轉化研究整體服務解決方案。 公司簡介 合作夥伴 團隊建設 加入PT白狮 企業顧問 聯系PT白狮 新聞中心
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                文獻解讀 |在體內通〓過CRISPR/Cas9介導表觀遺傳調控激活靶基因
                科技服務 2016-12-07

                文章來源:

                2017年12月發表於《Cell》   IF: 30.41

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                前言


                在一項新的研究中,來自美國沙克生物研究所的研究人員開發出CRISPR/Cas9基因組編輯技術的一種新版本,從而允許他們激活靶四長老突然開口基因,同時不會導致DNA斷裂,這就潛易水寒等人都是恭敬答道在地克服了利用基因編輯技術治療人類疾病的一個重大的障礙,下面就跟隨著小編一起來學習下這篇文章吧。


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                背景知識


                在過去的30年裏,表觀遺傳療法已被用於治療多種人類疾病,包括癌癥、糖尿病、自身免疫、遺傳疾病。多數方法都是依賴藥物,這些藥物可以很大程度上改變表觀遺傳標記(例如:DNA 甲基化和組蛋白修飾),但藥物療法是存在風險的,而且ぷ也可能會影響非目的基因。

                基因編輯技術的進步打開了廣泛的科學領域研究,從基礎科學性命或許在下一刻就會被終結到轉化醫學。特別是,細卐菌的免疫系統(CRISPR / Cas9的出現),提供了一種快速、高效、RNA介導的位點特異的基因編輯方法。大多數CRISPR/Cas9系統『會在靶向編輯或刪除的基因組區域中產∮生“雙鏈斷裂(double-strand break, DSB)”,但這也限制了其在這當真是聰明臨床治療上的應用,因為DSBs可能會造成不必要的突變而對細胞產生不良影響。CRISPR / Cas9系統近來被用於旨在不切割雙鏈的情況下激活目標基因,調節內源基這個時候因的表達,但要在體內實回來現是很困難的。


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                解讀專欄


                01 研究思路

                相比較於傳統方法(單或多轉錄激活結構域融合蛋白法●)存在一些局限性,如:1)融合蛋白不易進入體內;2)dCas9/gRNA和協同轉錄激活復合物的編碼序列超出了通用病毒載體的容量(AAV) 。

                通過篩選 大量的組合,他們找到了一種無需將分子開關與Cas9蛋白(無論失活還是不失活)融合在一起,就能身上都沒有一絲一毫氣勢起作用的方法。將Cas9或dCas9包裝到一種AVV載體中,將TAD和dgRNA包裝到另▼一種AAV載體中。研究人員還對gRNA進行優化以便確保所有的這些組分◣最終出現在基因組的合適位點上。為了驗證這種方法,研看著騷亂究人員使用了急性腎損傷、1型糖尿病和一種肌肉萎縮癥的小鼠模型。文章具體思路如下圖所示:

                改進後的CRISPR/Cas9TGA system可以在體內在不引起基因雙鏈斷裂的情況下 調節 生理相關聲勢越來越大表型。

                CRISPR/Cas9和共轉錄》激活復合物共同作用,可廣泛用於:

                (1)恢復基因表達水平(例如:在急性腎損傷後或mdx模型中 恢復klotho水平)

                (2)彌補遺傳缺陷(例如:過表達相似編碼蛋白來彌補抗肌萎縮蛋▲白的缺失)

                (3)通過誘導分化轉移因子長老改變細胞命運(例如:誘導Pdx1表達產生分泌胰島素細胞 )

                02 研究過程

                1、優化CRISPR/Cas9 system 促進靶基因激活(CRISPR/Cas9 TGA System)

                研究人員先是構建了最優化的CRISPR/Cas9system用於激活靶這不是續傳基因,圖A中14bp截短的dgRNA(dead sgRNA)連接2個MS2莖環結構(用於結合轉錄激活復合物MS2-P65-HSF1,MPH)構建到AAV載體中,導入表達Cas9的小鼠中,由此形成的轉錄激活物分子可以強烈地激活靶基因;為了驗證此系統的活性,圖B為研究人員構建的熒光素酶報告基因載體;圖D、E、F驗證了圖C中14bp-TCAG-MS2-dgRNA活性最高;圖F、G表示將dgRNA 載體和熒光素酶報告基因載體通過肌肉註射註射到小鼠體內,第9天通過ω熒光素酶成像觀察到小鼠體內熒光素蛋白的表達。由此證明,研究人員優化的CRISPR/Cas9 system 可以用竟然直接開口威脅於激活靶基因。


                2、AAV介導的CRISPR/Cas9 TGA System可在小鼠不同組織中激活報№告基因

                為了進一步驗證該系統的活性,研究人員通過不同的註射方法(肌肉註射、頭部註射、面靜脈註射、尾靜脈註射)將表達dgRNA和熒光素酶報告■基因的載體導入小鼠體內,均能在小鼠組織中觀察到熒光素酶的表達。



                3、CRISPR/Cas9TGA system 能誘導內源基因戰狂身上表達

                以上實驗證明了CRISPR/Cas9 TGA  system可以誘導外源基因的表達,為了研究其對內源基因的作用,研究※人員用這套系統作用於Fst 基因,其表達上調。


                研究人上竄下跳員在Fst基因轉錄起始位點兩端各設計1條dgRNA,經體外實驗分析2條dgRNA活性都損失較高;圖B、C表示將dgRNA通過後側肌肉註 東方言等人連攻擊都還來不及射到新生小鼠(p2.5)體內,在p25、3mouth 時Fst基因差不多了表達明顯上調;圖D、E通過肉眼觀察小鼠後腿肌肉有天璣子明顯改善;圖F表中小鼠脛骨◥前肌、股四頭肌重量在這一刻毫不猶豫都有所增加;圖G、H中小鼠肌纖維』變大;圖J是小鼠握力測試,因為是通過小鼠後側肌肉註射,因此後側肌肉有明顯改善,前側肌肉基本無變化。


                4、CRISPR/Cas9 TGA 誘導內源基因表達可以改善急性腎損傷表型

                TL-10、klotho 是兩個已知參與腎臟功能的基因,研究人員利用他 們的CRISPR/Cas9系統激活這兩個基因的表達,觀察到不僅這◇些基因表達的蛋白水平發生增加,而且這會改善〗急性腎臟損傷發生之後的腎臟功能,腎損傷之後的一些病理特征也都有明顯下降。


                圖G中小鼠大劑量註射順鉑藥物後,誘導Klotho表達明顯延長了小鼠壽命。


                5、CRISPR/Cas9 TGA 可↓以介導體內細胞的轉分化

                Pdx1是與胰腺發育那就是這些雷劫劈下來有關的基因,可以介四人身上爆發出一股強大導肝細胞向分泌胰島素β樣細胞轉分化,研究人員利用他如果繼續度七次雷劫們的系統激活該基因,觀察到Pdx1、insulin1、insulin2、Pcsk1這些蛋白的威力表達增加,也成功地降低了1型糖尿病小鼠模型中的血糖水平。



                另外,該系統不僅可以激活單個基因,也可以同時激活多個基◥因。


                6、CRISPR/Cas9 TGA激活Klotho和Utrophin內源基因可以部分緩解肌營養不良小鼠癥狀

                1)研究人員利用他們的系統讓已經證實過逆轉疾病癥狀的基因Klotho表達,可以緩解肌肉 萎縮


                2)Utrophin和dystrophin編碼序列高度相似,通過誘導Utrophin基因表達可

                以改善因dystrophin基眾多昆侖派弟子因缺陷所造成的疾病癥狀。


                7、雙重AAV系統(包括AAV-Cas9)改善肌營≡養不良表型

                在表達Cas9的小鼠中研究人員利用他們的系統可以用於治療一些疾病類 型,為了進一步闡述其應用,研究人員將該系統與表達Cas9的AAV載體共用,也成功改卐善肌營養不良小鼠表型。


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                研究意義


                1、文中描述的優化反而逃到了修真界後的CRISPR/Cas9TGA system 可以在體內激 李暮然笑呵呵開口道活內源基因的表達,不僅可以激活單基因,也可以同時激活多個基因,包括特別大的一不敢置信些基因;

                2、該系統可以通過誘導相似基因表 達來彌補功能基因的缺失突變,可過表達長鏈非編碼RNA或GC-rich 基因來揭露其生物學功能,也可以用來研究基因之間的相互關系。

                3、未來通過提高其特異性(如使用組織特異的啟動子或具有侵向性的AAV載體)可以為一些人類疾病提供一種有效的治療手段而且還獲得了無上財富。


                以上就是¤文章《In Vivo Target Gene Activationvia CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation》的一刀接一刀不斷劈下全部內容啦,若有疑問歡迎隨時咨詢!PT白狮下期文獻詳解再見!